Development of a software tool for modelling post-translational modifications of proteins

Посттрансляционные модификации (PTM) являются фундаментальным механизмом регуляции белков: они изменяют заряд и полярность боковых цепей, влияют на локальную и глобальную конформацию, устойчивость, взаимодействия и внутриклеточную локализацию, тем самым формируя функциональное разнообразие протеома

Доступные бесплатные решения по работе со структурой белков в первую очередь ориентированы на визуализацию и ручное редактирование. Сходные описываемому программному средству задачи частично решает PyTMs — плагин к настольному приложению PyMOL, предназначенный для удобного введения распространённых посттрансляционных модификаций прямо в окне визуализатора; авторы подчёркивают, что это простой исследовательский инструмент с удобным интерфейсом внутри среды просмотра

Цель исследования — создать оригинальное программное средство для моделирования посттрансляционных модификаций белков на основе геометрических и молекулярно-механических методов. Дополнительно цель включает проверку тезиса о том, что при соблюдении заданных геометрических допусков (длины связей, углы, минимальные межатомные расстояния) получаемая структура может рассматриваться как готовая к дальнейшему вычислительному анализу без обязательного запуска молекулярной динамики. Для достижения цели решались следующие задачи: разработать алгоритм геометрической достройки фосфатной группы к остаткам серина, треонина и тирозина; разработать алгоритм геометрической достройки ацетильной группы для остатков лизина; предусмотреть расширение списка внедряемых посттрансляционных модификаций; верифицировать корректность получаемых структур методом молекулярной динамики; сформулировать и зафиксировать критерии геометрической приёмки (целевые значения по длинам и углам, пороги по минимальным межатомным расстояниям) и показать, что при выполнении этих критериев результат может использоваться как готовая входная структура без обязательной молекулярно-динамической валидации; в качестве дальнейшей прикладной задачи — расширение перечня поддерживаемых посттрансляционных модификаций с сохранением единых геометрических принципов и автоматической проверки применимости.

Описываемое программное средство реализовано в виде веб-приложения EasyAcetoPhos и предназначено для точечного добавления фосфатных и ацетильных групп непосредственно в координаты PDB с немедленной проверкой локальной геометрии и понятной обратной связью в браузере. Выбор целевого аминокислотного остатка осуществляется кликом по участку трёхмерной структуры белка, отображаемой в окне просмотра, так и по символу в отображаемой на отдельной панели линейной последовательности; после выбора система оповещает пользователя, допустима ли операция для данного типа остатка и текущего состояния структуры

Пользователь загружает PDB-файл в веб-интерфейс, после чего ему становится доступно отображение трёхмерной структуры анализируемого белка. С этого момента целевой аминокислотный остаток можно выбрать либо кликом по интересующему участку трёхмерной структуры, либо через панель линейной аминокислотной последовательности. После выбора целевого остатка запускается автоматическая проверка применимости разных типов модификаций на основе типа остатка, наличия нужного атома присоединения, отсутствия уже внесённой модификации и минимальных межатомных расстояний в локальном окружении. Если условия нарушены, действие блокируется, что исключает ошибочные операции на раннем этапе. При прохождении условий проверки пользователю становится доступен выбор доступной модификации. При выборе применения модификации пользователем, модификация строится параметрически непосредственно в текущих координатах, затем структура обновляется в окне просмотра, пользователю становится доступна выгрузка результирующего PDB-файла. Полученный файл может быть использован в качестве исходных координат для последующей подготовки и расчётов молекулярной динамики в выбранном пользователем программном пакете.

Построение новых атомов выполняется на основе параметрической геометрии без внешних шаблонов. Для выбранного аминокислотного остатка определяется «якорный» атом присоединения: OG для серина, OG1 для треонина, OH для тирозина; для ацетилирования — NZ у лизина. Из координат исходного остатка формируется локальный правый ортонормированный базис: ось z задаётся направлением от атома Cα выбранного остатка к якорному атому. Направление оси x получается из вектора от Cα к Cβ с предварительной ортогонализацией к z и нормируется до единичной длины. Ось y определяется как направление, перпендикулярное одновременно и к x, и к z; выбор выполняется по «правилу правой руки», что обеспечивает правостороннюю и взаимно ортогональную тройку осей. Если координаты Cβ недоступны или ненадёжны (например, при альтернативных положениях атомов), в качестве второго опорного направления выбирается ближайший тяжёлый атом боковой цепи и проводится ортогонализация к z. Построение в таком локальном базисе делает дальнейшую расстановку новых атомов детерминированной и инвариантной к ориентации всей молекулы в глобальных координатах.

При фосфорилировании точкой присоединения служит гидроксил соответствующего остатка; перед вставкой удаляется связанный с ним водород. Атом фосфора размещается на фиксированном расстоянии от якорного атома кислорода вдоль локальной оси z; три кислорода фосфатной группы расставляются так, чтобы окружение атома фосфора было близко к тетраэдрическому с углами по 109.5° с равномерным разведением по азимуту. В используемых параметрах длина мостиковой связи O-P к боковой цепи берется ~1.60-1.62 Å, длины связей P-O в самой группе — ~1.48-1.52 Å; такая схема согласуется с классической тетраэдрической координацией P(V) и укорочением терминальных P=O по сравнению с одинарными P-O мостикового типа

При ацетилировании точкой присоединения является атом NZ боковой цепи лизина. Перед вставкой удаляется один из его водородов. Формируется амидная группа -C(=O)-CH₃, сохраняющая планарность и sp²-характер: углы вокруг C-N и C=O близки к 120°, диэдральные параметры выбираются в транс-ориентации относительно карбонила. Для длин связей используются типовые значения: для пептидной (амидной) связи C-N ≈ 1.33-1.35 Å и C=O ≈ 1.22-1.24 Å; эти параметры согласован с общеупотребительными ограничениями геометрии, применяемыми при уточнении белковых структур, и с классическим представлением о частично двойственной связи C-N как причине планарности пептидной группы

Контроль применимости модификации и локальной стереохимии выполняется до полноценного внесения изменений. Проверка корректности выполняется последовательно: сначала оценивается применимость операции (тип остатка, наличие якорного атома, отсутствие ранее внесённой модификации), затем — геометрия рассчитанного фрагмента и, наконец, проверка окружения. Геометрические цели формулируются как числовые «точки притяжения» для длин связей и валентных углов; допустимые отклонения заданы узкими допусками, согласованными с практикой рестрейнов при уточнении белковых структур: для длин — порядка ±0.08 Å, для углов – порядка ±5°. Если отклонения попадают в расширенные, но ещё допустимые коридоры (например, до ±0.12 Å по длинам и до ±8° по углам), операция помечается как требующая внимания, иначе — блокируется. Стерические конфликты оцениваются по all-atom-подходу: фиксируются перекрытия между несвязанными атомами с учётами водородов, при превышении порога, принятого в валидации (перекрытие ≥ 0.4 Å), модификация не применяется

Программное средство разделено на серверную часть и интерфейс, что позволяет отделить вычислительную логику от визуализации и обеспечить детерминированность работы при повторных вызовах. Серверная часть реализована в виде REST API с помощью языка программирования Python и фреймворка FastAPI. Разработаны конечные точки, отвечающие соответственно за проверку применимости операции к выбранному остатку, применение модификации с вычислением новых координат, выдачу численных характеристик для интерфейса, экспорт полученной структуры. Выбор FastAPI обусловлен сочетанием высокой скорости и типобезопасной схемы описания маршрутов, что упрощает поддержку и документирование API

Пользовательский интерфейс работает в браузере на основе плагина Mol*, поэтому выбор остатка, к которому будет применена модификация, возможен как по клику на трёхмерной структуре белка, так и через панель линейной последовательности; оба способа синхронизованы и приводят к одному и тому же серверному запросу. После ответа сервера интерфейс сразу подсвечивает выбранный участок, сообщает статус применимости операции и активирует или блокирует соответствующие кнопки. По завершении операции интерфейс автоматически перерисовывает отображение трёхмерной структуры белка с уже модифицированным остатком и предлагает скачать обновлённый PDB-файл. Такой сценарий опирается на стандартные механизмы выбора и уровня детализации в Mol*, делая взаимодействие предсказуемым и воспроизводимым

[9]

,

[17]

. На рисунках 1 и 2 отображён интерфейс реализованного программного средства.

Рисунок 1 - Интерфейс программного средства. Белок без модификации

DOI:10.60797/BIO.2025.8.3.1

Рисунок 2 - Интерфейс программного средства. Белок с применённым к одному из остатков фосфорилированием

DOI:10.60797/BIO.2025.8.3.2

В совокупности сервер и интерфейс образуют простой и надежный инструмент, в котором параметры модификации рассчитываются на сервере на основе геометрических правил и пороговых значений, а браузерный интерфейс обеспечивает прозрачную обратную связь и контроль корректности на каждом шаге.

Входными данными для программного средства являются файлы в формате PDB, содержащие в себе исходные структуры анализируемых белков. При получении на вход от пользователя PDB файла, имя файла нормализуется и проверяется по расширению, после чего сохраняется в рабочем каталоге сервера. Дальнейшая обработка выполняется через стандартную объектную модель пакета Biopython с парсингом файла в соответствующую иерархию, содержащую информацию о структуре, модели, цепях, остатках и атомах. Результат применяемой модификации сохраняется в формате PDB с теми же идентификаторами цепей и исходной нумерацией, изменяется только трёхбуквенный код модифицированного остатка на стандартизованное имя: фосфорилированные остатки серина, треонина и тирозина получают имена SEP, TPO и PTR соответственно, ацетилированный остаток лизина получает имя ALY. Для прозрачного сопоставления с исходными данными используется унифицированная схема имён файлов: к базовому имени исходного файла PDB добавляется код цепи, номер остатка и тэг модификации через двойное подчёркивание, например 1ESX__A15_PTR.pdb. Такая организация облегчает навигацию по результатам.

Валидация геометрии модифицированных структур выполнялась вне разработанного программного средства, в отдельном расчётном цикле молекулярной динамики в пакете GROMACS с использованием GPU на сервере биологического факультета Белорусского государственного университета. Подготовка систем включала построение топологии в силовом поле CHARMM36 с моделью воды TIP3P, сольватацию и ионизацию до физиологической концентрации, а также стандартные этапы энергетической минимизации, уравновешивания при постоянной температуре и давлении и производственного расчёта динамики на 50 наносекунд. Для расчёта дальнодействующих кулоновских взаимодействий применялся метод частично-сеточного Эвальда с гладкой интерполяцией зарядов (smooth PME), являющийся принятым стандартом для биомолекулярных систем в GROMACS

Анализ траекторий был направлен на два аспекта: устойчивость локальной конформации в зоне модификации и сохранность заданной при вставке геометрии самой модифицирующей группы. Сходимость конформации контролировалась по среднеквадратичному отклонению координат (RMSD) относительно опорной структуры, а локальная подвижность — по среднеквадратичным флуктуациям (RMSF) атомов выбранного фрагмента

В анализ включены 10 систем с ацетилированием лизина и 15 систем с фосфорилированием серина, треонина и тирозина, производственный участок 50 наносекунд с отбрасыванием первых 10 наносекунд как периода уравновешивания. Сайты, на которые вносились модификации, отбирались случайно из допустимых позиций, для репрезентативности локальной геометрии соблюдался баланс по типам вторичной структуры для охвата разнообразных локальных окружений. Конкретные параметры отдельных запусков приведены в сопроводительных таблицах 2–4. Целевые термодинамические условия соответствовали стандартной постановке в водной среде TIP3P под управлением термостатирования и баростатирования после предварительной энергетической минимизации и коротких этапов NVT/NPT. По сводным метрикам рассчитанных серий средняя температура оставалась близкой к цели (около 300 K, диапазон от 299.981 до 300.073 K), мгновенные колебания давления соответствуют ожидаемой статистике для малых систем, а плотность системы находилась в узком интервале от 1018 до 1049 кг/м³, что согласуется с выбранной моделью растворителя и подтверждает корректность постановки расчётов (табл. 5).

Для оценки сходимости и подвижности использовались две стандартные метрики: среднеквадратичное отклонение координат (RMSD) и среднеквадратичная флуктуация (RMSF). RMSD показывает, насколько в среднем атомы выбранного фрагмента отклоняются от опорной конфигурации: чем меньше значением RMSD, тем стабильнее форма фрагмента относительно исходной. RMSF характеризует амплитуду колебаний каждого атома вокруг его среднего положения вдоль траектории, низкие значения означают умеренную локальную подвижность. Для оценки выхода на равновесие ориентируются на достижение плато по ряду величин, в том числе энергии и RMSD, именно выход на плато по RMSD служит практическим признаком завершения уравновешивания; единых норм для абсолютных значений RMSD/RMSF не существует: интерпретация контекстна, а ключевым критерием служит стабилизация профиля RMSD и умеренные RMSF в рассматриваемом фрагменте

Геометрия фосфатной и ацетильной групп в динамике. Мостиковая связь между кислородом боковой цепи и фосфором (O-P) в среднем составляет 1.576 ± 0.020 Å (диапазон 1.557–1.604 Å), что близко к целевому диапазону 1.60-1.62 Å, заданному на этапе геометрической вставки. Длины связей внутри самой фосфатной группы имеют значения P-O₁ = 1.476 ± 0.001 Å (1.474–1.478 Å), P-O₂ = 1.475 ± 0.002 Å (1.473–1.477 Å) и P-O₃ = 1.551 ± 0.005 Å (1.544–1.561 Å). Для двух связей P-O значения лежат в пределах целевого диапазона 1.48–1.52 Å, а третья демонстрирует небольшое смещение к верхней границе, оставаясь при этом близкой к ожидаемой для фосфатных фрагментов. Для фосфатных фрагментов типичны тетраэдрические окружения фосфора и различающиеся длины связей: мостиковые P-O порядка 1.60 Å  и немостиковые 1.48–1.52 Å

Для амидного фрагмента — связь азота ε-группы лизина с карбонильным углеродом ацетильной группы — средняя длина N-C равна 1.338 ± 0.001 Å (1.337–1.339 Å), что соответствует ожидаемым значениям для частично двойственной амидной связи. Длина C=O карбонила — 1.226 ± 0.001 Å (1.224–1.227 Å) и C(карбонил)–C(метильный) — 1.483 ± 0.001 Å (1.482–1.486 Å) также согласованы с целевыми интервалами, принятыми при геометрической вставке. Планарность амидного фрагмента обусловлена частично двойственным характером связи C-N, типичные длины — около 1.33 Å (C-N) и 1.23 Å (C=O), углы в плоскости должны быть близки к 120°

Тесные межатомные контакты оценивались как доля кадров траектории, в которых в окрестности модификации отсутствуют недопустимо малые расстояния между несвязанными атомами. По сводному показателю для всех 25 систем получено одинаковое значение: доля кадров без тесных контактов равна 100% во всех случаях. Иными словами, на всем 40-нс производственном участке всех 25 проанализированных систем ни в одной из траекторий не наблюдались пространственные конфликты вокруг вставленной группы, что согласуется с корректностью изначальной геометрической вставки и ее устойчивостью в динамике.

В целом модификации сохраняют ожидаемое водородное окружение. По всем системам среднее число водородных связей между модифицированной группой и белком составило 2.074 на кадр, а со стороны воды — 5.245. Такая картина согласуется с тем, что фосфатные группы активно гидратируются, тогда как ацетильные группы чаще формируют умеренное число контактов с ближайшими белковыми донорами/акцепторами. В расчётах использован стандартный геометрический критерий водородной связи, рекомендованный в практиках GROMACS

В совокупности результаты по всем траекториям показывают согласованную картину. В зоне модификаций не фиксировались недопустимые сближения несвязанных атомов на всем производственном интервале, то есть геометрическая вставка групп не порождала производственных конфликтов при последующей релаксации. Водородное окружение соответствует химической природе модификаций: фосфатные группы на остатках серина, треонина и тирозина формируют разветвленную сеть контактов с ближайшими донорами и акцепторами белка и одновременно стабильно гидратируются. Ацетильная группа на лизине удерживает планарную амидную геометрию и дает умеренное число водородных связей, при этом ее взаимодействие с водой и белковым окружением остаются воспроизводимыми от системы к системе. В терминах динамики это выражается в том, что локальная форма модифицированного фрагмента после короткой релаксации стабилизируется: разброс отклонений координат и амплитуд колебаний невелик для фосфатных модификаций и остается умеренным для большинства ацетилированных случаев несмотря на отельные более подвижные траектории.

Показательные примеры иллюстрируют оба полюса поведения. Для фосфорилирования тирозина (структура 1EQ0, цепь А, остаток 4) наблюдается «спокойная динамика»: форма фрагмента мало меняется, целевые длины и углы фосфатной группы сохраняются, а конфликты отсутствуют. Для ацетилирования лизина (структура 1A03, цепь А, остаток 18) фоновые колебания заметнее, но плоская амидная геометрия и ориентировка ацетильной группы удерживаются, и, как в первом случае, недопустимые сближений не возникает. Эти два сценария — стабильный и более подвижный – демонстрируют главное: построенные на геометрических правилах модификации корректно достраиваются в исходные структуры и сохраняют физически правдоподобную локальную геометрию и окружение в динамике.

Совокупность наблюдений о сохранении целевых длин и углов, отсутствии недопустимых сближений, стабильности локальной конформации поддерживает вывод о достаточности геометрических критериев приёмки: при статусе “PASS” проверка методом молекулярной динамики может не проводиться и оставляется на случаи с повышенной неопределённостью.

Анализ полученных траекторий показывает, что построенная на основе геометрических правил локальная структура модификации удерживается в динамике без дополнительной ручной подгонки. Длины связей и валентные углы остаются в целевых диапазонах, тесных контактов с несвязанными атомами на производственном участке не наблюдается. Отсутствие атом-атомных перекрытия — тот самый критерий, на который принято опираться при атомарной валидации, — подтверждает, что стартовая геометрия корректна и не создаёт артефактов при релаксации

Такая устойчивость локальной геометрии важна с прикладной точки зрения: модифицированная структура в формате PDB получается сразу готовой к расчётам и не привязана к конкретному программному пакету. Её можно напрямую передавать в любой стандартный конвейер молекулярной динамики, не вставляя дополнительных ручных стадий правки координат или локальной подгонки

Сопоставление с ближайшими по задачам инструментами подчёркивает нишу предполагаемого подхода. Плагин PyTMS решает введение распространённых PTM внутри настольного визуализатора и тем самым удобен для интерактивной ручной работы, но логика его использования остается редакторской — без встроенного сценария немедленной геометрической проверки и без фокуса на детерминированной, воспроизводимой вставке в текущих координатах

Рисунок 3 - Автоматическая проверка локальной геометрии

DOI:10.60797/BIO.2025.8.3.8

Ограничения текущей версии разрабатываемого программного средства определяются покрытием модификаций и объёмом внешней валидации. Полный набор результатов приведён для фосфорилирования серина, треонина и тирозина, для ацетилирования лизина показана серия на 6 белках, где часть случаев демонстрирует повышенную подвижность окружения при сохранении локальной планарной геометрии. Запуск молекулярной динамики выполняется отдельно от веб-интерфейса, выбор пороговых значений расстояний и углов фиксирован и ориентирован на классические значения, без адаптации под конкретные силовые поля. В текущей реализации не решаются задачи автоматической перепараметризации редких остатков и сложных ковалентных вариантов, как, например, полиацилирование или перекрёстные сшивки.

Ближайшие шаги логично продолжить в следующем направлении: расширение класса модификаций на основе тех же параметрических принципов, добавление автоматических проверок стереохимии и локальных контактов для новых типов модификаций, унификация отчётномти о статусе применимости для всех модификаций. Параллельно целесообразно добавить более строгую валидацию расстояний, по возможности включить автоматическую калибровку допусков под выбранное силовое поле, экспорт геометрических характеристик для каждой вставленной модификации, чтобы облегчить независимый аудит результатов. Такое развитие программного средства сохранит его центральную идею — детерминированную геометрическую вставку и прозрачную проверку — при одновременном расширении области применимости и глубины контроля.

В работе представлен легковесный веб-сервис EasyAcetoPhos для геометрической вставки посттрансляционных модификаций непосредственно в координаты PDB, обеспечивающий быструю и воспроизводимую подготовку модифицированных структур, с немедленной проверкой локальной геометрии и наглядной обратно связью. Реализовано фосфорилирование остатков серина, треонина и тирозина, а также ацетилирование лизина. Модификации строятся параметрически по целевым длинам связей и углам и автоматически стандартизуются в выходной PDB. Интерфейс позволяет выбирать целевой остаток как в линейной последовательности, так и непосредственно на трёхмерной модели белка, перед применением модификации выполняется проверка допустимости проведения такой операции и окружения, что предотвращает ошибочные действия. Внешняя верификация методом молекулярной динамики на фосфорилированных и ацетилированных системах показала сохранение целевых длин и углов, устойчивость локальной конформации и отсутствие недопустимых тесных межатомных контактов на производственном участке траекторий. При попадании метрик в заданные допуски и получении статуса “PASS” результат работы сервиса следует считать готовой для дальнейших расчётов и анализа структурой, запуск молекулярной динамики не является обязательным и применяется адресно, по исследовательской необходимости. Тем самым инструмент закрывает нишу между визуализаторами, ориентированными на ручное редактирование, и тяжёлыми конвейерами подготовки к расчётам, обеспечивая быстрое и воспроизводимое построение модификаций, совместимое с любым пакетом молекулярной динамики. В дальнейшей работе планируется последовательное расширение поддержки посттрансляционных модификаций и улучшение автоматических критериев приёмки.